即便大友宗麟有降服之意，可身在前线的上杉军诸将却并不知情，他们可没有获得八条景定的停止攻击的命令。
岛津家船大将比志岛义基率两艘关船、三艘小早，并顺路带着弥助等五名黑人抵达别府湾海面后，就发现小早川隆景、九鬼嘉隆、安宅清康、忽那通着、高原次利、宫本传太夫等人就已经趁着涨潮之际，向残存的丰后水军众发起了勐攻。
若林镇兴、若林九郎、若林弹正忠、若林上总介、若林大炊助等丰后水军众诸将所乘战船很快就陷入了重重包围之中。
此时的上杉军不断用焙烙玉、火失、铁炮、大铁炮、佛郎机炮等火器对丰后水军众战船进行集火攻击，使得丰后水军众一时间被打得毫无还手之力，损失惨重。
作为丰后水军众旗头的若林镇兴不愿在别府湾葬送丰后水军众，就意图率残部进行突围，但均被上杉军利用优势火力所击退，若林一族中的若林弹正忠、若林上总介、若林大炊助等人更是先后被上杉军击毙。
若林镇兴见突围不成，便打算向上杉军投降。却被小早川隆景、九鬼嘉隆等人当即拒绝。
万般无奈之下，若林镇兴只能抱着全员玉碎向主家大友家尽忠的心态，率剩余的两艘关船、五艘小早向上杉军发起最后的反击。
可九鬼嘉隆却不打算给丰后水军众任何抵近的机会，直接下令将两艘铁甲船调转方向，用船舷一侧面向丰后水军众战船，利用佛郎机炮的射程优势，不断炮击丰后水军众战船。
由于此时正值大风，丰后水军众其中一艘关船被铁甲船上的佛郎机炮打穿了甲板，并命中火药存放点，导致瞬间燃起大火，并蔓延整艘船体，甚至连边上的小早也被波及点燃。
不少丰后水军众的船夫被迫跳入海中，以避免被烧死。
不久，若林镇兴的坐舰也遭到了铁甲船的炮火覆盖而迅速进水，关船上的船夫大都选择跳海逃生，只有若林镇兴一人还端坐在关船的船舱之中，与舰同沉。
最后，丰后水军众阵亡达六百余人，大友家最为重要的水军众也在此战中被彻底歼灭，别府湾海面尽赤。
因小早川隆景、九鬼嘉隆等人深知葡萄牙战船并未参战，也不清楚葡萄牙战船的数量以及沿海地区大友家所配置的兵力、火器，就不敢继续趁胜攻入沿海地带，便见好就收，退往别府湾外围进行封锁，并向景定上报此战所获得的战果。
而这时的景定为了施加上杉将军家在南九州三国的影响力，在听闻原松尾城城主土持亲成率土持一族因奋力抵抗大友家南下侵攻北日向而先后阵亡一事，便特意从土持家庶流中找到了土持亲成的族侄土持亲纲，让其继承土持家家督以及担任松尾城城主。